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[猪病大全] 猪繁殖与呼吸综合症诊断研究进展

  猪繁殖与呼吸综合症(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS)于1987年首先报道于美国,现已遍及全球主要养猪国家和地区,给整个养猪业造成了不可估量的损失。1992年国际兽疫局(OIE)将PRRS列为8类传染病,并要求每一成员国在每年末必须发布其疫情报告和控制措施。PRRS的特征为:母猪生殖障碍、仔猪及育成猪呼吸困难。最初,由于病因不明曾被命名为“猪神秘病”(Mysteryswinedisease,MSD)、“猪蓝耳病”(Blue—eareddiseaseofpigs,BEPD)、“猪流行性流产和呼吸综合症”(Porcineepi-demicabortionandrespiratorysyn—drome,PEAKS)、“猪不育和呼吸综合症”(Swineinfertilityandrespiratorysyndrome,SIRS)等10多个病名。l992年在美国明尼苏达州圣保罗市召开的“首届SIRS/PRRS国际研讨会”将其统一定名为欧共体倡议的“猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)”,并为大多数国家所接受。我国一般俗称为“猪蓝耳病”。自从1996年哈尔滨兽医研究所郭宝清等首次报道该病在我国存在以来,全国已有20多个省(市)报道过该病的流行,而且近几年发病率较高。我国《一、二、三类动物疫病病种名录》中PRRS被列为二类动物疫病进行法定管理。



  在具体介绍PRRS的诊断之前有必要先对其病原学作一简要描述。荷兰中央兽医研究所首先分离鉴定出病原,并以该研究所所在地将其命名为Lelystadvires(简称LV)。目前,该病毒在国际上被通称为“猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRKSV)”,并且第10届国际病毒学大会将其列入新成立的动脉炎病毒科。PRKSV有两个血清型:即美洲型(代表株为VR2332)和欧洲型(代表株为Lv)。目前,我国分离出的主要为美洲型。PRRSV专嗜在猪肺泡巨噬细胞内生长,且可产生明显的细胞病变(CPE),对pH值及温度变化非常敏感。三种主要结构蛋白为:核衣壳蛋白(N)、基质蛋白(M)及囊膜蛋白(E),其中N蛋白免疫原性最强。


  临床诊断


  流行病学


  本病发生无明显季节性,在自然流行中仅见于猪。不同年龄、品种和性别的猪均可感染,母猪和仔猪的症状较为严重,肥育猪则较温和。病猪和带毒猪是主要传染源。感染猪可通过唾液、鼻腔分泌物、粪尿、精液及乳汁等方式向外排毒。病毒可通过空气、接触、胎盘和交配等方式传播,其中接触是主要传播途径。猪肉及其产品一般认为不会传播本病。


  临床症状


  妊娠母猪发生流产(多发生于妊娠后期)、早产、死产、产木乃伊胎。死产胎儿常出现自溶、水肿皮肤呈棕褐色。仔猪眼睑肿胀,结膜炎,有些四肢外展呈“八”字形。少数发病母猪和仔猪耳朵、鼻盘、腹部、和四肢内侧等薄皮处呈紫色。生长肥育猪临床表现温和,常没有任何临床症状。


  如果发现妊娠母猪后期发生流产,新生仔猪死亡率高,而其它猪临床表现温和;或者观察到患猪的耳朵、四肢末端和乳头、阴部等处皮肤发绀,同时具有传染性时,都应首先考虑患PRRS的可能性。也可根据荷兰提出的简易诊断方法:20%以上的胎儿死产;8%以上母猪流产;断奶前有26%以上的仔猪死亡。三项中有两项符合即可得出初步诊断,不过这种方法只适合急性PRRS。


  病理变化


  大体病变仅出现于呼吸系统和淋巴组织。肺脏呈红褐花斑状,不塌陷。病变最常出现在前腹侧区域;淋巴结中度到重度肿大,呈褐色,子宫颈淋巴结、胸腔前上侧淋巴结和腹股沟淋巴结最明显。显微病变主要表现为间质性弥漫性肺炎:肺泡壁增厚,肺间质增宽,肺泡及肺泡膈水肿和炎性细胞浸润,肺泡中常有蛋白碎片及变性的细胞存在,病变可见于所有的肺叶。


  有报道说急性PRRS病猪在临床显现期和濒死期出现五大病理变化:①急性败血症;②全身性的巨噬细胞和血管内皮细胞肿大、活化或增生;③间质性肺炎;④广泛性的微循环障碍;⑤非化脓性脑炎。


  病毒分离鉴定


  病毒分离是诊断PRRS最确切的一种方法一般采用易感细胞分离法。目前用于分离PRRSV的细胞主要有如下几种:猪原代肺泡巨噬细胞(PAM)、CL一2621细胞、MA一104细胞系的克隆株MarC一145。采集病猪的血清和肺组织分离成功率最高。将病料接种新培养的原代PAM或其它传代细胞系,经传代后出现特征CPE者,表明病毒分离呈阳性。由于不同分离株在细胞培养上生长繁殖情况各不相同,故在进行病毒分离的同时,可用间接荧光法染色观察荧光反应或将所分离的病毒制成超薄切片进行电镜观察,还可用PCR法增殖病毒抗原,作遗传基因鉴定,从而使结果更为可靠。


  血清学试验


  血清学方法是目前广泛应用于实验室的诊断方法,国内外已建立了四种检测PRRSV抗体的方法。l991年荷兰中央兽医研究中心Wensvoort等率先建立了免疫过氧化物酶单层细胞试验,美国农业部国家兽医服务实验室Yoon等建立了间接荧光抗体技术(1—FA)和血清中和试验(sN)。Taki-rawa等用PRKSV接种MarC一145制备阳性抗原建立了ELISA方法。


  免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)


  IPMA是最早问世的检测PRRS抗体的血清学试验方法,至今仍是欧洲常用的检测手段,它具有较高的敏感性、特异性,能从感染后6天的猪体中检测出PRRS抗体。不足之处是:IPMA结果判定有一定主观性,不能自动显示,常依靠肉眼判定,费时,大规模检测太昂贵,因此未得到广泛应用。


  间接荧光抗体试验(IFA)


  该法在美国广泛被应用,其特异性与敏感性与IPMA相似,能从感染后6天的动物体内检测出PRRSV抗体,可用于PRRSV的抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测。IFA可在PAM、CL-2621、MA一104及MarC一145培养物上进行,血清抗体滴度≥1:20时判为阳性,血清抗体滴度≥1:64作为PRRSV活动性感染标志。缺点是实验结果判断依肉眼观察,主观性较强,不利于自动化操作,不适于大规模检测,因而使用受到一定的限制。


  血清中和试验(SN)


  该法特异性好,可以区别不同的PRRS病毒株。但需要大工作量的微量细胞培养,技术性强;既费时,又费力,判断具有主观性,且抗体出现时间迟,故不适于早期诊断目前仅限于实验室研究应用。


  酶联免疫吸附试验(ELISA)


  用ELISA可检测PRRS抗体,其方法是用PRRSV接种PAM培养作已知阳性抗原,并用相同方法制备模拟抗原,当阳性抗原孔的0D值与模拟抗原孔的OD值之比大于1.5时,即可判样品为阳性。ELISA的特异性与IPMA相同,但敏感性更强,法国已将ELISA作为监测和诊断本病的常规方法。ELISA具有抗原用量少、节省材料,能自动显示结果、诊断速度快,在进行大规模检测中经济方便等优点,是一种便于普及的好方法。如能进一步改进,无疑会有广泛的应用前景。


  分子生物学诊断


  分子生物学技术已成为现代医学不可缺少的一种疾病诊断方法。人们开始利用单克隆抗体技术、聚合酶链反应(PCR)技术和核酸探针技术等方法对PRRS进行分子诊断和分型,从分子水平揭示抗原变异的基础和毒株演化过程。


  单克隆抗体技术


  单克隆抗体技术可以用于鉴定不同来源毒株的抗原表位,很多学者用不同的PRRSV毒株研制成功了多种PRRSV单克隆抗体。由于PRRSV单抗与PRRSV不同的结构蛋白有不同的反应特性,其中有的单抗能够与所有毒株反应,有的则只与欧、美洲型毒株中1个型发生反应,因此运用单克隆抗体可以很容易的区别PRRSV的美洲型和欧洲型。单抗技术不仅可以用于病毒的分型,同样可以区分野毒株和疫苗株。


  PCR技术


  RT—PCR


  RT—PCR操作简便、安全可靠、便于自动化,可检测10TCID50/mL精液的病毒,适合对精液排毒进行检测。RT—PCR的敏感性要比间接免疫荧光反应高,当结合South-ern印迹和免疫荧光检测时可大大提高其敏感性。因精液对PAM敏感,不适用于用血清学检测,故此法可代替血清学试验应用于精液样品的检测。此外因PRRSV基因容易降解,故RT—PCR技术的关键之一为病毒基因的提取。


  RT-nPCR


  套式PCR法即提取病毒RNA后,反转录为cDNA,用第一对引物进行PCR扩增,然后以该扩增产物为模板用第一对引物进行第二次PCR扩增。对急性、亚急性及康复期猪的肺脏组织均可用RT—nPCR检测病毒RNA。精液中的病毒含量低,常规RT—PCR有时不能检出,将套式PCR引入RT—PCR可使其敏感性提高l00倍以上。因其临床样品检出率高于病毒分离,故可用于对精液排毒的监测及亚临床感染和病毒持续感染研究。若将此法和放射性标记探针技术结合,可大大提高其特异性和敏感性。


  核酸探针原位杂交技术


  用地高锌标记标记的PRRSVN蛋白基因的cDNA制备特异性探针,用原位杂交(ISH)检测甲醛固定的石蜡组织切片。其优点是在感染早期和后期均能检出PRRSV的RNA。该方法快速、特异、敏感,可用于临床诊断和抗原定位。


  结语


  临床上由于PRRS的症状复杂多样、无特征性症状,病变不明显、不典型,且常常继发、并发其它疾病,故临床诊断只能作为初步诊断。确诊需进一步采取病料进行病毒的分离鉴定、血清学或分子生物学诊断。


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