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[猪病技术] 美国猪鼻支原体野毒分离株的遗传多样性

  前言


  自2008年底以来,猪鼻支原体相关疾病一直是美国肉猪行业关注的一个重要问题。不同毒力的猪鼻支原体,感染机体时会表现出不同的宿主免疫应答,以及在继发感染中发挥不同作用而表现出临床症状。从多发性浆膜炎和关节炎病例中通过细菌分离和PCR检测很容易检出细菌,目前还没有能有效描述出猪鼻支原体分离株在猪群中传播情况的基因型工具。本研究目的是发展多位点序列分型(MLST)方法用于描述猪鼻支原体的野毒分离株。


  材料和方法


  2010年至2011年,美国病猪的38个猪鼻支原体分离株,以及一个ATCC菌株(美国典型菌种保藏中心),用于本次研究。这些分离株来源于11个地区、18个系统、猪的3个阶段和7个不同损伤部位。分离株培养7-14天,接着提取DNA。调制典型的MLST方法获取管家基因(核苷酸累积改变缓慢)以及高变基因(短期累积改变)。尽可能考虑到提高这种调制方法的分辨能力,标记这些更有利于疫情调查的基因。选择这些目的基因后,设计引物并进行PCR扩增。PCR产物用标准Sanger测序法(双脱氧链终止法)进行双向测序。序列使用ClustalW(多序列比对方法)比对并调整到同样大小片段。利用MEGA5.2.1(分子进化遗传分析软件)和BionumericsV7.1(生物信息分析软件)进行系统发育分析(Phylogeneticanalysismas)。


  结果


  超过25个基因能在不同程度结果范围内作为具有潜力的目的基因。最终MLST方案中包括以下基因:ung,pdhB,mtlD,p3和p95。每个基因的核苷酸变异范围在0.5-20%之间。每个基因的等位基因变异数量在3-11之间,39个分离株产生了27个序列类型(STs)。系统树显示,检测的分离株存在遗传变异,具有极大相似性的分离株属于相同宿主/系统。观察2个主要家系:A和B,大多数检测分离株属于家系B,并且都来自明尼苏达州。分离部位在系统树中没有相关性,然而家系A中大多数分离株分自胸膜。从相同部位分离的聚集在一起,但某些情况是分离部位相同、地理位置不同。通过比较,分离于不同部位、地区和病变类型的3株有100%序列相似性。这些案例显示都来自于猪(图1)。



  图1运用5个基因的级联序列,分析39个分离株的相关性。


  作为鉴定每一个分离株的关键点(宿主编号-地区-年份-病变-年龄)


  结论及讨论


  本实验方法能够进一步研究这种病原体感染的流行病学和动力学。此外,本方法在兽医和生产者了解疾病发生方面非常有用,选择分离到的疫苗产品,进行代表性分离株潜在起源的流行病学研究。因此,美国养猪业将能够更好地控制观察到的引起养殖场猪群重大死亡的病原。


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