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[猪病技术] 屠宰场中种猪的肺炎支原体分离株的基因多态性

  猪肺炎支原体在全世界的猪群中普遍存在。猪肺炎支原体是猪地方性肺炎主要的致病原因。在养猪业中,这种情况与猪呼吸性疾病和减产有关,使猪的经济价值受到损失。猪肺炎支原体的重要性还与其能加重病毒和细菌感染的能力有关。当这些病原体与猪肺炎支原体协同感染时,呼吸系统的病变则更加严重。此外,猪肺炎支原体还可以增加猪圆环病毒2型抗原数量和感染的持久性,并可以增加仔猪多系统衰竭综合症的发生率。


  由于猪肺炎支原体有较长的潜伏阶段并且经常与猪鼻支原体(在青年猪上呼吸道正常存在的支原体)混合感染,很难实现猪肺炎支原体的分离培养。猪肺炎支原体也与包括地方性肺炎和呼吸道疾病等猪的多种疾病相关。


  利用DNA随机扩增多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)和脉冲电场凝胶电泳(PFGE)等分型技术对全世界的猪肺炎支原体分离株进行基因组水平分析,发现它们之间存在高异质性。然而,RAPD和聚丝氨酸重复分析在不同的实验室只有微弱的重现率,并且APLP和PFGE技术的要求是很严格的。因此,基于DNA扩增的新技术在近几年里发展了起来。多个位点的串联重复序列分析(MLVA)和PCR结合限制性片段长度多态性分析(PCR-RELP)是两种执行起来比较简单的方法,是可重现和具有高辨识力的方法。可用MLVA技术来区分样品中猪肺炎支原体种类,之前已有不同农场中猪肺炎支原体分离株遗传差异性的研究,还有其他研究报道了同一隔离畜群中猪肺炎支原体分离株基因的差异性和同源性。地方性猪肺炎支原体分离株也存在毒力差异。


  事实上,人们对加拿大的猪肺炎支原体分离株知之甚少。本项研究的目的在于探讨屠宰场里单一或混合感染的猪群中猪肺炎支原体分离株的基因多态性。从由48个农场供给猪只的2个屠宰场中采集160份患有地方性肺炎的猪的受损肺组织,肺损伤范围从2%到84%不等。89%(143/160)肺样本的实时PCR检测结果为猪肺炎支原体阳性,而10%(16/160)肺样本和8.8%(10/160)肺样本的PCR检测结果则分别为猪鼻支原体阳性和絮状支原体阳性,只有6%肺样本的细菌培养结果是猪肺炎支原体阳性。单独的猪肺炎支原体分离株以及混合的猪鼻支原体和猪肺炎支原体对抗生素都有相对较低的最小抑菌浓度(表1)。在最小抑菌浓度稍高的分离株中并没有发现抑制基因或突变位点,这可能意味着这些支原体缺少获得抗生素耐药性的能力。


  在挑选出来的猪肺炎支原体为阳性的25份肺组织样本中,有9份混合感染了猪鼻支原体,9份混合感染猪圆环病毒,2份混合感染了蓝耳病毒,12份混合感染了2型猪链球菌,10份混合感染了禽多杀性巴氏杆菌(表2)。无论肺部损伤是否严重,猪肺炎支原体的MVLA和PCR-RELP集群分析都显示,菌株主要为3和5集群,说明集群与毒力没有必然的相关性。然而,值得注意的是,缺少特定MLVA位点的菌株所致病变较轻微且菌株数量较少。MLVA和PCR-RFLP分析还显示,在具有较大同质性的同一群体之间,猪肺炎支原体分离株之间有着极大的差异性。几乎一半的分离株与挑选的疫苗和参考菌株之间只有少于55%的同源性。


  表1猪鼻支原体和猪肺炎支原体培养物的最小抑菌浓度



  粗体数字表示猪肺炎支原体在纯培养基中的最小抑菌浓度


  灰色区域,没有测试浓度


  表2肺的损伤程度和肺炎支原体定量提示屠宰场的猪流行性肺炎是否混合感染其他病原



  猪鼻支原体、蓝耳病、圆环病毒2型是用PCR检测,而s链球菌、巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、a链球菌、传染性胸膜肺炎通过传统的细菌培养检测。


  aMhp:猪肺炎支原体Mhr:猪鼻支原体转移培养物用多重PCR证实


  蓝耳病病毒:猪繁殖与呼吸综合征病毒;PCV2:猪圆环病毒2型;APP:胸膜肺炎放线杆菌


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